Immunologie - Définition

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L'immunologie en pratique

L'immunologie dans les laboratoires de diagnostic et dans la recherche

La connaissance des mécanismes immunologiques a permis le développement de nombreuses techniques d'analyses aussi bien quantitatives que qualitatives, utilisant notamment les anticorps, vecteurs de l'immunté humorale, mais aussi parfois des tests cellulaires. La maitrise de production des anticorps a ouvert le champ à de nombreuses technique de purification par "affinité", mais aussi des applications thérapeutiques.

Techniques

La plupart de ces techniques utilisent les propriétés des anticorps monoclonaux ou polyclonaux purifiés par affinité. Leur affinité et leur spécificité de liaison à leur cible fait d'eux des outils incontournables de détection ou capture spécifique. Ils permettent de déterminer la présence dans un échantillon complexe d'un Antigène ou même d'une de ses parties particulière(épitope). De nombreuses modalités de mise en oeuvre existent

techniques avec anticorps non marqués

Les premières techniques d'analyse proposées utilisaient des anticorps non marqués, par exemple dans le réactions de précipitation, les réactions d'agglutination (ex: "test de Coombs"), turbidimétrie ou néphélométrie et les réactions de neutralisation. On utilise la capacité de former des complexes immuns multiples de l'antigène cible et des 2 sites des IgG ou 5 sites des IgM, et éventuellement le fait que l'anticorps est fixé ou se fixe à des cellules ou des particules (agarose). Les complexes antigène-anticorps deviennent visibles macroscopiquement de manière diffuse (opacité par turbidimétrie) ou locale (précipitation), éventuellement après coloration, ex. au Bleu de Coomassie.

Par exemple dans plusieurs méthodes dites d'immunoprécipitation (ex. Ouchterlony), l'anticorps présent dans un gel immobilise un antigène diffusant depuis un puits, et on visualise une ligne blanche représentant la précipitation du complexe immun formé. Il existe une variante faisant appel à l'Électrophorèse (Fused Rocket Electrophoresis). D'autre techniques similaires sont utilisées en recherche pour déceler des interactions entre deux protéines ou pour purifier un composé dans une solution.

techniques avec anticorps marqués

Des méthodes devenues plus fréquentes consistent à utiliser des anticorps marqués, "détectables" facilement, cad couplés à avec des composés colorés ou le plus souvent fluorescents, des particules d'or, des enzymes qui produiront un signal coloré fluorescent ou luminescent, ou de petits composés détectables indirectement (biotin, "tags"), voire des élémentes radioactifs. La réaction ag/ac est mise en oeuvre en phase homogène ou héterogéne. Par exemple cette dernière modalité se décline dans les techniques comme l'ELISA, le blotting ou le micro-réseau, selon que le support est une microplaque, membrane, lame de verre... Ces techniques d'analyse in-vitro permettent de détecter des protéines ou autres molécules, de facon qualitative (spécificité) et/ou semi-quantitative (par titration, comparé à un titration de standards). L'ELISA sur microplaque est une technique très flexible, de la R&D au contrôle qualité ou au screening. Selon la spécifité des anticorps, on peut détecter de faibles différences ou modifications entre molécules (isoformes de protéines, phosphorylation, acétylation, etc.). Le microréseau permet de tester qualitativement des centaines de milliers de molécules (ou anticorps) sur 1 cm2 ("Screening"), avec 2 ou 3 paramètres (anticorps . Le western blot après électrophorèse 2D permet de distinguer qualitativement et quantitativement dans un même échantillon des protéines et leurs variant (profiling).

D'autres techniques utilisent le principe de l'ELISA, mais le support consiste en la cible à détecter, par exemple une cellule ou un virus. Par exemple une coupe de tissus est "marqué immunologiquement" (fixation de l'anticorps), et on analyse avec un microscope les cellules "colorées" par l'anticorps (Immuno-Histochimie (IHC)), ou rendu fluorescentes (Immuno-Fluorescence (IH) - on observe l'intensité de la fluorescence, ou son changement de longueur spectrale (ratiométrie), ou le changement de polarisation de la fluorescence (Fluorescence Polarization), ou le temps entre l'excitation et l'émission (Life Time Resolved Fluorescence) ). Ces immuno-analyses renseignent sur la localisation d'antigènes, dans une cellule ou un tissus, et leur relative abondance. Une limitation repose sur la résolution optique, et sur la superposition des antigènes (dans l'épaisseur de la coupe), ce qui est partiellement adressé par scaning focal (Microscopie confocale). En Cytométrie de flux ("FCM"), on marque les cellules en suspension, qui sont analysée individuellement, ce qui rend l'information très puissante (populations cellulaires, notamment en multiple détections, d'autant que les cellules peuvent être triées.

Les techniques d'analyse immunologique (immuno-métrique si elles sont rendues quantitatives) utilisant des anticorps marqués recourent souvent à des systèmes d'amplication, qui repose souvent sur plusieurs anticorps, dont des anticorps "secondaires", marqués et reconnaissant les anticorps "primaires" spécifiques de la cible à détecter. Elles peuvent être multiplexées dans divers techniques (ELISA Fluo, MicroArray, W-Blot, IHF, CMF): 2 et jusqu'à 4 anticorps spécifiques marqués différement sont utilisés simultanément, et l'on peut alors avoir des résultats multiples sur le même échantillon (simultanément, ou après superposition). Des variantes combinent des billes pour atteindre jusqu'à 48 détections. D'autres modalités permettent d'apprécier la distance entre 2 molécules (FRET, BRET).

autres techniques

Une autre propriété des anticorps utilisée en clinique animale et depuis quelques années en clinique humaine est la faculté de certains isotypes d'anticorps à lier le complément, et donc de lyser les cellules à la surface desquelles ils sont fixés. En pratique, cela permet de détruire les cellules possédant un marqueur antigénique particulier (techniques de "lyse").

Les techniques de purification par affinité utilisent les anticorps couplés chimiquement à des résines pour capturer des antigène cibles (éventuellement complexés à d'autres partenaires - technique voisine de l'immunoprécipitation). Les applications vont de la R&D à l'industrie (fabrication).

Applications

Les applications des analyses immunologiques sont majeures en R&D, en diagnostique médical et vétérinaire, et même en controle qualité (alimentaire).

Sérologie

Le diagnostic des infections bactérienne (ex la toxoplasmose) ou virales (ex le VIH, l'hépatite B) se base le plus souvent sur la détection d'anticorps circulants dans le sérum des patients (parfois dans d'autres fluides). La technique la plus utilisée est l'ELISA 'direct'.

Détection immunologique directe d'agents pathogènes

La technique la plus utilisée est l'ELISA avec les modalité dites 'sandwich' et 'inhibition' (ou 'compétition'), en colorimétrie (EIA: Enzyme ImmunoAssays) ou radiométrique (RIA: RadioImmunoAssay), plus rarement fluorescence. Mais comptent aussi la cytométrie de flux pour des cas plus difficiles et recherche hospitalière, le micro-réseau qui se développe pour préciser le diagnostique avec plus de paramètres. Enfin la Microscopie avec immunochimie (IHC) est très utilisée pour préciser le (ou à defaut de) diagnostique sérologique, dans les hopitaux, et même l'immunofluorescence (IF). Ceci vaut aussi pour le cancer (cf infra).

Détection immunologique de paramètres biologiques

Les immuno-analyses sont capables de doser certains analyses circulants, et de détecter des marqueurs cellulaires normaux (qui signent le type ce cellule, ou une activité -récepteur,enzyme-) ou cancéreux.

La détermination de la formule lymphocytaire fait appel à la cytométrie en flux, utilisant des anticoprs monoclonaux couplés à des molécules fluorescentes spécifiques de marqueurs (cluster de différentiation CD4/8...).

Le dosage d'hormones dans le sérum est fait souvent par ELISA, mais certaines (hormones thyroïdiennes notamment) se font par turbidimétrie ou néphélométrie.

La recherche du cancer du colon et du pancréas se fait par ELISA avec quelques marqueurs frequents (par ex le CA19-9)Marqueurs tumoraux

Divers

En clinique animale et depuis quelques années en clinique humaine on recours à la faculté de certains isotypes d'anticorps à lier le complément, et donc de lyser les cellules à la surface desquelles ils sont fixés.

L'immunologie dans la pratique médicale

La connaissance de l'immunologie et les techniques immunologiques sont présentes à de nombreux niveaux en médecine, du diagnostic au développement de vaccins, du traitement de maladies auto-immunes au thérapies par greffe ou utilisant des anticorps.

L'utilisation de toutes sortes de vaccins a permis le triomphe de la médecine contre de nombreuses maladies infectieuses. Ainsi, la variole est éradiquée, et d'autres maladies sont des candidats à l'éradication par la vaccination : la rougeole, l'hépatite B par exemple. Ce sont des maladies causées par des virus dont l'être humain est le seul réservoir. La vaccination d'une grande partie de la population permettrait de les éradiquer. Ce sont des objectifs fixés par l'organisation mondiale de la santé.

Par ailleurs, il existe depuis 2006 un vaccin destiné à diminuer le risque de cancers du col de l'utérus. Ce vaccin est dirigé contre un virus responsable de la transformation des cellules épithéliales du col en cellules tumorales. Vacciner les jeunes filles avant leurs premiers contacts sexuels permettrait de diminuer de 80% les cas de cancer du col.

L'immunologie et l'étude du système immunitaire est un outil indispensable pour deux domaines particuliers : le rejet de greffe et les maladies auto-immunes, comme le diabète. Parallèlement, l'immunologie des tumeurs étudie comment le système immunitaire interagit avec les cellules tumorales, dans le but d'influencer médicalement la puissance potentielle d'une réaction immunitaire dirigée contre une tumeur.

Côté thérapeutique, on utilise des anticorps modifiés ("humanisés") pour véhiculer des agents toxiques (toxines, radioéléments) jusqu'à des cellules cibles cancereuses pour détruire des tumeurs (Immuno-Thérapie). Similairement mais pour du diagnostic, des anticorps spécifiques de marqueurs tumoraux sont marquées (fluorescence ou radioactivité faible (Immunoscintigraphie|Immuno-Scintigraphie)) et injectés au patient avant imagerie médicale afin de diagnostiquer ou localiser des tumeurs avant chirurgie. A ces applications pointues, appelons enfin simplement l'importance des techniques immunologiques classiques pour le diagnostic médical, sérologique ou infectieux notamment -voir ci dessus section techniques & applications-.

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