Dès la fin du XIXe siècle, les scientifiques isolèrent des agents infectieux, invisibles au microscope optique, qui passaient à travers les filtres de porcelaine utilisés pour recueillir les bactéries. Pasteur les nommait « infrabactéries », d'autres les qualifiaient de « virus filtrants » ou « virus ultrafiltrants ». Vers 1925, la définition d'un virus était devenue un agent responsable d'une maladie infectieuse, parasite, de nature particulaire et de taille comprise entre 0.01 et 0.3 microns.
À la fin du XIXe siècle, la conception d’agents infectieux qui n’étaient ni des bactéries, ni des champignons, ni des parasites était encore difficile.
Entre 1887 et 1892, le botaniste russe Dimitri Ivanovski étudia une maladie végétale, la mosaïque du tabac, et montra que la sève des plantes malades contenait un agent infectieux qui n’était pas retenu par les filtres Chamberland conçus par le biologiste du même nom. Ivanovski pensait qu’il s’agissait d’une toxine ou bien d’une très petite bactérie. C’est le chimiste hollandais Martinus Beijerinck qui approfondit ces travaux et, en 1898, écarta non seulement l’hypothèse bactérienne mais aussi l'hypothèse toxinique : diluant la sève de plantes infectées il l'inocula à des plantes qui développèrent la maladie; réitérant la manipulation il put transmettre la maladie de multiples fois et démontrer que la sève de la dernière plante infectée était aussi virulente que la première, effet qu'une toxine, après tant de dilutions n'aurait pu produire. Beijerinck appela l'agent Contagium vivum fluidum ('soluble living germ'). À la même époque, le virus de la fièvre aphteuse est le premier virus identifié par Friedrich Löffler et Paul Frosch. Le virus de la fièvre jaune est le premier virus pathogène de l’Homme identifié entre 1900 et 1902.
C’est pendant la Première Guerre mondiale que l’anglais Frederick Twort et le microbiologiste franco-canadien Félix d'Hérelle mettent en évidence le phénomène de « lyse transmissible » observable par la lyse des bactéries cultivées en milieu solide. Ce phénomène est dû à un virus de bactéries que Félix d'Hérelle baptisa bactériophage. Les virus des plantes, des animaux, de l’Homme et des bactéries étaient ainsi découverts et leurs listes ne cessèrent de s’allonger au cours du XXe siècle. L’apparition de la microscopie électronique dans les années 1930 permit l’observation des virus, mais on ne savait toujours pas à cette époque ce qu’ils étaient réellement.
Le biochimiste américain Wendell Stanley cristallisa le virus de la mosaïque du tabac sous forme de cristal protéique en 1935. L'année suivante, des études complémentaires montrèrent que ce cristal contenait également de l’ARN. Les études ultérieures montrèrent que selon les virus étudiés, ceux-ci étaient composés soit de protéines et d’ARN, soit de protéines et d’ADN. C’est en 1957 qu'André Lwoff proposa une définition claire et moderne des virus.
À partir des années 1960, le développement des cultures cellulaires, de la microscopie électronique, puis de la biologie moléculaire permit aux scientifiques de progresser dans la compréhension des mécanismes de réplication des virus, dans la réalisation de diagnostics fiables et dans l’élaboration de vaccins.