L'université a été fondée en 1798, lorsque l'assemblée générale du Kentucky décida d'implanter un établissement d'enseignement supérieur dans la toute nouvelle ville de Louisville, sur un terrain de 24 km2.
Le 3 avril 1798, des fonds furent levés pour lancer l'école alors connue sous le nom de Jefferson Seminary. L'école ouvrit seulement en 1813, en proposant des cours secondaires. L'école dut néanmoins fermer ses portes en 1829. En 1837, le conseil municipal de Louisville fonda l'institut médical de Louisville.
En 1846, l'institut de médecine fusionna avec le Louisville Collegiate Institution et une école de droit fut également créée. D'autres facultés apparurent rapidement au XXe siècle en ingénierie, en chirurgie dentaire, en musique, en aide sociale…
En 1931, l'université fusionna avec l'école pour noirs Louisville Municipal College dans un but de déségrégation, mais ce n'est qu'en 1951 que le collège fusionna réellement avec le reste des entités. Dans la seconde moitié du XXe siècle, des facultés de commerce, d'éducation et d'administration virent le jour.
L'université était à ce jour une université privée et ce n'est qu'au début des années 1960 que des discussions prirent forme pour en faire une université publique. Elle ne devint publique qu'en 1970 grâce à la poussée de l'ancien étudiant de l'université, devenu gouverneur du Kentucky, Louie Nunn. L'université maintenant publique souffrit au début quelque peu du manque de fonds. Des facultés en infirmerie et en administration publique apparurent toutefois.
John Shumaker devint président de l'université en 1995 et il put lever d'énormes fonds en faveur de l'université. En 1997, des infrastructures sportives furent ajoutées près des campus. Le taux de rétention a depuis augmenté et des bâtiments dans le domaine des nanotechnologies et de la recherche médicale ont été ajoutés.
L'université est aujourd'hui composée de 12 facultés :
Les Cardinals de Louisville ont rejoint la Big East Conference depuis juillet 2005, après 10 ans passé dans la division Conference USA. L'université est surtout connue pour son équipe de basket-ball masculine et pour son équipe de volley-ball féminine. L'équipe de basket rapporte chaque année 18,5 millions de dollars de revenus, grâce au merchandising.