Résonance magnétique nucléaire - Définition

Utilisations

Le caractère non destructif de cette technique analytique a conduit à divers développements de cette méthode qui est désormais employée en médecine pour étudier le corps humain (IRM), ou en chimie organique pour réaliser des analyses structurales.

C'est un outil de biophysique très utilisé en génomique structurale pour obtenir une 'image' en 3D des molécules du vivant.

La RMN en chimie organique

Spectromètre RMN 200 MHz avec passeur automatique d'échantillons utilisé en chimie organique pour la détermination des structures chimiques.

La RMN est l'outil d'analyse actuellement le plus utilisé en chimie organique. Elle permet d'obtenir des informations qualitatives ou quantitatives sur l'échantillon analysé, suivant la technique employée. Les noyaux les plus souvent étudiés sont le ¹H, le ¹³C, le ¹⁷O, le ³¹P et le ¹⁹F qui présentent, pour la plupart, un spin nucléaire non nul égal à 1/2. Le ¹⁴N quant à lui présente un spin nucléaire égal à 1 tandis que celui de l'oxygène est de 5/2.

L'échantillon à analyser est mis en solution dans un solvant deutéré (voir ²D, un isotope de l'¹H présentant un spin nucléaire égal à un). Ce solvant, généralement du chloroforme deutéré, (CDCl₃) est normalement invisible en RMN du proton, puisque le deutérium a une fréquence de résonance bien différente de celle de l'hydrogène (le rapport gyromagnétique vaut 6,54 MHz/T dans le cas du Deutérium).

Considérons la RMN du ¹H : l'environnement chimique des atomes d'hydrogène qui sont reliés chimiquement aux molécules de l'échantillon influent sur la fréquence de résonance de ceux-ci ; ainsi, l'hydrogène d'un groupement alcool (-OH) aura une fréquence de résonance ν1 supérieure à celle de l'hydrogène d'un groupement carboxyle (-COOH) ν2. Comme la différence entre ces deux fréquences est de quelques hertz, les chimistes ont défini une autre grandeur : le déplacement chimique (chemical shift), et se réfèrent à une fréquence de retournement de spin étalon, celle du tétraméthylsilane (TMS), que l'on introduit dans l'échantillon.

La relation entre la fréquence de résonance de l'échantillon ν₁ et le déplacement chimique correspondant δ₁ est donnée par le calcul suivant :

Dans les cas cités, le déplacement chimique vaut environ 4 pour RO-H, et 11 pour R-COO-H.

La RMN du ¹H peut être relativement rapide (ordre d'idée : 2 min) et permet une analyse quantitative aisée. Grâce à l'interprétation de la nature des massifs obtenus (multiplets) et à la connaissance empirique des déplacements chimiques des protons présents dans chaque groupement fonctionnel, il est possible de déterminer la structure développée de toutes les molécules organiques par application d'un raisonnement logique simple.

La RMN du ¹³C permet de retrouver tous les carbones de la molécule grâce, là aussi, à la connaissance empirique des déplacements chimiques des carbones faisant partie de divers groupements fonctionnels. Les appareils récents permettent d'obtenir rapidement les spectres RMN ¹H et ¹³C, ceux-ci avec ou sans découplage du proton.

La RMN impulsionnelle

Les premières méthodes utilisées étaient soit de garder le champ magnétique constant et de balayer les fréquences, soit de garder la fréquence constante et de balayer le champ magnétique. Ces méthodes étaient longues car nécessitaient le relevé d'un grand nombre de mesures. La RMN impulsionnelle permet de gagner énormément de temps. Une impulsion électromagnétique extrêmement brève et intense est envoyé sur l'échantillon. Or plus une impulsion est brève, plus son spectre est large. Ce sont donc tous les noyaux qui vont être stimulés en même temps. Il suffit donc de récupérer le signal réémis par l'échantillon et de le décomposer en fonction simple grâce à des séries de Fourier. De cette manière, on extrait le spectre RMN après un traitement mathématique mais en n'ayant fait qu'une mesure.

Cette méthode est souvent schématisée par une analogie avec un diapason de musicien : pour trouver la fréquence de résonance du diapason (la note de musique pour laquelle il sert de référence, le plus commun étant le La 440 à 440Hz), on a deux choix :

• jouer une large gamme de notes sur un instrument de musique et observer laquelle fait résonner le diapason (balayage de fréquences), ou
• frapper le diapason contre une surface dure - ce qui est l'analogie avec l'impulsion très brève et énergétique - et écouter quelle(s) note(s) on obtient.

La RMN impulsionnelle correspond à cette deuxième méthode.

La RMN en imagerie médicale et biophysique

IRM encéphalique (coupe sagittale passant par la ligne médiane)

L'imagerie par résonance magnétique nucléaire (IRM) est une technique d'imagerie médicale permettant d'avoir une vue 2D ou 3D d'une partie du corps. Cette technique est très utile pour l'observation du cerveau. Grâce aux différentes séquences (séquence IRM), on peut observer différents tissus avec des contrastes très élevés car la résolution en contraste est nettement meilleure que celle du scanner.

La RMN en informatique quantique

La RMN en biologie structurale

À côté de la radiocristallographie, la RMN est devenue une méthode d'étude des macromolécules biologiques en solution. Elle ne nécessite pas l'obtention de monocristaux et permet d'étudier des protéines, des acides nucléiques à des concentrations millimolaires. Les techniques de RMN multidimensionnelles conduisent à corréler les fréquences de plusieurs spins et de résoudre les ambiguïtés liées aux superpositions spectrales. Des protéines de masse moléculaire de 10 à 30 kDa peuvent être analysées ainsi que des oligonucléotides de plusieurs dizaines de paires de bases.

Spectromètre RMN 800 MHz utilisé en biologie structurale.

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RMN homonucléaire sans marquage isotopique

Historiquement, les protéines ont été étudiées par la RMN du proton (isotope ¹H) présent en abondance.

Une première étape consiste à attribuer les résonances, c'est-à-dire à établir une corrélation entre les signaux du spectre et les atomes d'hydrogène de la molécule. Deux expériences clefs sont utilisées, l'expérience de corrélation par les couplages scalaires (HOHAHA ou TOCSY) et l'expérience de corrélation à travers l'espace par effet Overhauser (NOESY). Cette attribution est dite séquentielle, car elle opère par positionnement relatif d'un noyau par rapport à ses voisins en utilisant l'information de la séquence peptidique. Ce processus d'attribution (semblable à un puzzle) devient de plus en plus complexe à mesure que la taille de la protéine augmente; de plus, l'effet Overhauser se transmet à travers l'espace et ne permet pas de distinguer des noyaux proches dans la séquence peptidique et ceux proches dans l'espace. Des erreurs sont donc possibles qui ne se détectent qu'à la fin du processus, lorsque certaines pièces du puzzle restent sur le tapis.

Une fois les spectres attribués, les informations sont alors utilisées de manière quantitative : les couplages scalaires renseignent sur les angles dièdres et les effets Overhauser sur des distances interatomiques (jusqu'à 4-6 angströms). Ces informations sont introduites dans des programmes de modélisation moléculaire pour rechercher une ou plusieurs conformations de la molécule compatibles avec les données. La stratégie est comparable à celle du géomètre qui mesure des distances et des angles entre bâtiments et recalcule un plan de ville. Sauf que la portée des distances mesurées en RMN est faible par rapport aux objets évalués; l'accumulation des erreurs expérimentales et/ou le faible nombre de données conduit à des structures localement mal définies.

Deux difficultés limitent la taille des macromolécules étudiables : la complexité des spectres et la largeur individuelle de chaque signal. Si la taille de la protéine double, le nombre de résonances dans le spectre va doubler sans que la dispersion (c'est-à-dire la largeur spectrale) n'augmente. Une solution consiste à recourir à un spectromètre RMN à plus haut champ… et donc beaucoup plus coûteux. Si la taille double, la masse moléculaire augmente et la protéine tourne plus lentement sur elle-même par mouvement diffusif. Cela conduit à des signaux plus larges, car la relaxation transversale devient plus performante. L'augmentation du champ magnétique est sans effet… et il faut trouver une autre parade au problème (réduction de la viscosité, réduction du nombre de protons voisins…).

RMN hétéronucléaire avec marquage isotopique

Afin de résoudre les superpositions spectrales dans les grosses molécules, il s'avérait nécessaire de passer de la RMN 2D à la RMN 3D. Des essais peu fructueux ont été faits au début des années 1990 pour combiner les séquences HOHAHA et NOESY dans une expérience tridimensionnelle. Si on dispose d'une protéine entièrement enrichie en ¹⁵N et en ¹³C, on peut concevoir des expériences de corrélation entre spins, uniquement fondées sur des couplages scalaires et permettant de relier tout le squelette peptidique ainsi que les chaînes latérales. Les isotopes naturellement abondants sont respectivement le ¹⁴N (noyau quadrupolaire) et le ¹²C (noyau invisible en RMN), mais la plupart des protéines étant obtenues par surexpression bactérienne, il est possible de faire des cultures sur des milieux enrichis isotopiquement.

Cette nouvelle stratégie fait appel à une série d'expériences 3D triple résonance: 3D car un spectre tridimensionnel est obtenu, triple résonance car les fréquences de trois noyaux différents sont détectées. Pour des raisons de sensibilité, toutes ces séquences partent du ¹H (noyau au rapport gyromagnétique élevé) et se terminent par la détection du même noyau. Dans l'expérience HNCO, on établit donc une corrélation entre le proton amide (^HN), son azote (N) et le carbonyle (CO) de l'acide aminé précédent. Les couplages scalaires utilisés pour les transferts de cohérence sont des couplages ¹J (à une liaison) et donc relativement importants (¹JNH = 90 Hz et ¹JNCO=15Hz). Cela assure donc une grande efficacité de transfert même dans le cas de protéines de masse élevées (largeur de raie). À noter que cette expérience HNCO permet de relier par couplage scalaire des acides aminés, ce que la stratégie homonucléaire ne permettait pas (absence de couplage scalaire 3J à travers la liaison peptidique)