Le F-105 a été intensivement utilisé pendant la guerre du Viêt Nam. Les premiers avions sont déployés dès 1965 et participent notamment à l'opération Rolling Thunder de bombardement massifs du Nord Viet-Nam. Le bilan des opérations conduit à effectuer un certain nombre de modifications sur les F-105D : renforcement du blindage, amélioration du système de tir et du siège éjectable, ajout de détecteurs d'alerte radar, etc. En 1969, un nouveau système LORAN AN/ARN-92 est installé sur 30 avions pour améliorer la précision du bombardement, le AN/ARN-85 d'origine s'avérant peu fiable.
En plus des missions de bombardement menées par les F-105D, des F-105F et F-105G Wild Weasel sont déployés pour détruire les systèmes anti-aériens adverses ou simplement brouiller les communications. Alors que les F-105D sont retirés des premières lignes à la fin des années 1960, les Wild Weasel resteront engagés jusqu'à la fin de la guerre.
Plus de 350 avions ont été perdus au combat pendant la guerre du Viêt Nam, dont 126 rien qu'en 1966. Les F-105 sont crédités de 28 victoires en combat aérien contre des MiG-17 Fresco. Cependant, 23 Thunderchief furent abattus par la chasse nord-vietnamienne.
Le 11 décembre 1959, un F-105B établit un nouveau record mondial de vitesse en volant à 1 957 km/h sur un circuit de 100 km.