Le concept scolastique de substance avait été peu abordé dans les méditations sur la philosophie première. Descartes aborde plus longuement ce point dans les Principes de la philosophie (1644).
L'idée que Descartes se fait de Dieu n'est guère comparable à celle que peuvent s'en faire les hommes qui ne font pas de philosophie. En effet, pour Descartes, Dieu est la substance absolue qui renferme en elle-même toute la réalité, toutes les perfections possibles et toutes les qualités possibles. Être une substance, cela signifie exister par soi-même (per se), sans le concours d'un autre être (Principes de la philosophie, I, 51).
A proprement parler, seul Dieu est donc une substance: tous les êtres créés par Dieu sont en effet finis, et dépendent de lui. C'est pourquoi Descartes affirme que la notion de substance n'est pas univoque: seul Dieu est, à proprement parler, substance. Toutefois, pour les choses créées, on parle de substance lorsqu'elles n'ont besoin que du concours ordinaire de Dieu pour continuer à subsister; les autres choses sont des « qualités ou des attributs de ces substances » (Principes..., I, 51). Ainsi, la pensée est un attribut de la substance pensante (res cogitans), tandis que l'étendue est un attribut de la substance corporelle.
Pour Descartes, la seule pensée ne peut être la cause de mon existence en tant que chose pensante: il faut un acte qui me crée, en tant que substance pensante, et me maintienne dans l'existence. Je ne me sors pas moi-même du néant, et je n'ai pas le pouvoir de me maintenir par moi-même. Il y a donc un être dont l'acte est de maintenir la création en l'état: c'est la théorie de la création continuée.
Une objection fut formulée par Hobbes et par Gassendi : nous ne connaissons que des qualités (des attributs, des phénomènes) : nous n'avons aucune perception immédiate de la substance. Descartes accorde toutefois que nous ne percevons, en tant que tel, aucune substance; il soutient que nous pouvons néanmoins la penser, et que nous pouvons la connaître par ses attributs (Principes..., I, 52). Ainsi, c'est parce que j'ai conscience de penser, que je peux inférer l'existence d'une substance pensante: cogito, ergo sum. Je m'aperçois moi-même penser; or la pensée est un attribut de la substance pensante; donc je suis une substance pensante. Il n'y a pas d'attribut sans substance chez Descartes: « le néant ne peut avoir aucuns attributs, ni propriétés ou qualités: c'est pourquoi, lorsqu'on en rencontre quelqu'un, on a raison de conclure qu'il est l'attribut de quelque substance, et que cette substance existe » (ibid.): autrement dit, il ne peut y avoir de pensée sans sujet pensant. Nietzsche critiquera précisément ce point-ci, refusant la possibilité d'inférer de la pensée au sujet pensant.
Spinoza, quant à lui, refusait le dualisme de substance cartésien, élaborant un monisme de la substance: seul Dieu peut être dit substance.
Descartes établit une classification des connaissances en comparant la connaissance à un arbre :