Avec Lise Meitner, puis avec son assistant Fritz Strassmann, il se lança, dès 1935, dans l'étude de ce que l'on pensait être alors des transuraniens. À la fin de 1938, avec Fritz Strassmann, grâce à une analyse radiochimique méticuleuse, Otto Hahn découvrit la fragmentation de l'uranium en deux noyaux plus légers, phénomène qui fut appelé « fission ». L'article portant leur signature fut envoyé à la revue Naturwissenschaften le 22 décembre 1938 et publié dans le numéro du 6 janvier 1939. Il s'agit là de l'acte de naissance de l'énergie nucléaire.
Otto Hahn se vit décerner le prix Nobel de chimie de 1944 « pour sa découverte de la fission des noyaux lourds ». Le gouvernement nazi avait souhaité qu'il refusât ce prix. Il ne put aller le recevoir qu'à la fin de l'année 1946.