On connait encore très mal les monotrèmes et surtout les ornithorynques, ainsi certaines légendes qui s'étaient formées au début de sa découverte sont toujours répandues dans le public, par exemple la notion d'animal primitif proche des reptiles. En fait, les monotrèmes sont les descendants d'une branche de mammifères qui s'est détachée très vite des autres mammifères, les thériens ; cette autre branche se serait divisée par la suite pour donner les marsupiaux et les placentaires. Ceci est contraire à la théorie de William King Gregory qui en 1947 avait fait d'abord diverger les marsupiaux des autres placentaires avant de faire diverger les monotrèmes des autres marsupiaux, ce qui a été infirmé par les recherches postérieures à la date précitée.
Une équipe internationale a déchiffré son génome et a publié son analyse dans la revue Nature du jeudi 8 mai 2008. Le travail de cette équipe confirme que les caractéristiques de reptile, d'oiseau et de mammifère de cet animal se retrouvent au niveau de son génome. L'ornithorynque a conservé l'état ancestral de certains caractères, qui a été également conservé chez les reptiles ou les oiseaux (le clivage méroblastique du zygote par exemple), alors que ces caractères ont évolué (ils sont donc dans un état dérivé) chez les autres Mammifères. Dans l'exemple précédent du clivage du zygote, le clivage holoblastique est donc apparu après la divergence Protothériens/Euthériens. L'ornithorynque a également développé des états dérivés de caractères spécifiques à ce taxon, comme l'électrolocalisation. Au cours de leur analyse, les chercheurs ont comparé ce génome avec ceux de l'homme, du chien, de la souris, de l'opossum et de la poule : l'ornithorynque partage 82 % de leurs gènes, ont-ils décelé. Il compte environ 18 500 gènes, soit environ les 2/3 de celui de l'homme.
Les plus vieux fossiles connus de l'actuel ornithorynque datent d'environ 100 000 ans, c'est-à-dire de l'ère quaternaire. Les monotrèmes disparus, comme le Teinolophos et le Steropodon, étaient relativement proches des actuels ornithorynques. Le Steropodon fossilisé découvert à Lightning Ridge en Nouvelle-Galles du Sud daterait de l'époque des dinosaures, il y a 110 Ma, ce qui en ferait le plus vieux mammifère trouvé en Australie. On a retrouvé de lui une mandibule avec 3 molaires alors que les actuels ornithorynques adultes sont édentés. On pensait que cette disposition tribosphénique des molaires datait de l'origine des monotrèmes, ce qui aurait conforté la théorie de Gregory en les rapprochant des reptiles, mais les recherches ultérieures ont montré que cette évolution s'était faite de façon séparée. Monotrematum sudamericanum, un autre fossile parent de l'ornithorynque, a été découvert en 1991 en Patagonie, en Argentine, montrant que les monotrèmes existaient déjà à l'époque du supercontinent du Gondwana qui a éclaté voilà environ 167 Ma pour donner l'Antarctique, l'Australie et l'Amérique du Sud.
En raison de leur divergence précoce avec les thériens et du petit nombre d'espèces de monotrèmes, ces animaux sont souvent des sujets d'étude pour comprendre l'évolution des espèces animales. En 2004, des chercheurs de l'université nationale australienne ont fait une découverte originale : Le sexe des thériens est déterminé par une paire de chromosomes ; la femelle possède deux chromosomes X, et le mâle un X et un Y. Chez les oiseaux, le mécanisme est similaire, mais le mâle est ZZ et la femelle WZ. Grâce à des marqueurs fluorescents, ils ont mis en évidence que l'ornithorynque dispose de cinq paires de chromosomes sexuels. La femelle est caractérisée par une séquence XXXXXXXXXX tandis que le mâle dispose d'une séquence XYXYXYXYXY. De plus, les chromosomes du début de la chaîne ont des gènes communs avec les mammifères, tandis que ceux de la fin partagent des gènes avec les oiseaux. Cependant, il manque sur les chromosomes Y le gène SRY qui, chez les autres mammifères, est un gène fondamental de la détermination du sexe de l'animal. Ceci fait qu'on ne connaît pas encore comment se fait la différenciation sexuelle chez cet animal.