Microscope électronique - Définition

Préparation des échantillons

Un insecte recouvert en or avant d'être examiné avec un microscope électronique à balayage.

Les matériaux appelés à être regardés sous un microscope électronique peuvent nécessiter un traitement afin de produire un échantillon approprié. La technique requise varie selon le modèle et l'analyse requise :

• Fixation chimique pour les spécimens biologiques visant à stabiliser la structure macromoléculaire mobile du spécimen par réticulation chimique des protéines avec des aldéhydes tels que le formaldéhyde et le glutaraldéhyde, et les lipides avec le tétroxyde d'osmium.
• Cryofixation - gel rapide du spécimen, à la température de l'azote liquide voire de l'hélium liquide, afin que l'eau forme de la glace vitreuse (non cristalline). Cela préserve le spécimen dans un état instantané de sa solution. Tout un champ appelé cryo-microscopie électronique est dérivé de cette technique. Avec le développement de la cryo-microscopie électronique de sections vitreuses (CEMOVIS), il est maintenant possible d'observer des échantillons de pratiquement tous les spécimens biologiques dans un état proche de leur état naturel.
• Déhydration - lyophilisation, ou remplacement de l'eau par des solvants organiques comme l'éthanol ou l'acétone, suivi de la phase critique de séchage ou d'infiltration de résines d'enrobage.
• Intégration des spécimens biologiques : après la déshydratation des tissus pour l'observation dans le microscope électronique à transmission, le spécimen est intégré, c'est-à-dire sectionné. Pour ce faire, le tissu est passé au travers de «solvants de transition», tels que le propane et l'époxy puis infiltré avec une résine, telle que la résine époxy Araldite ; les tissus peuvent également être intégrés directement dans l'eau avec de la résine acrylique. Après la polymérisation (durcissement) de la résine, l'échantillon est sectionné en minces tranches et coloré ; il est alors prêt pour l'observation.
• Intégration des matériaux : après incorporation dans la résine, le spécimen est habituellement poli avec un fini de type miroir en utilisant des produits abrasifs ultra-fins. Le processus de polissage doit être effectué avec soin afin de réduire au minimum les rayures et autres artefacts dus au polissage, qui réduisent la qualité de l'image.
• Sectionnement : on produit de fines tranches du spécimen, semi-transparentes aux électrons. Celles-ci peuvent être coupées avec un ultramicrotome au tranchant de diamant, pour produire des tranches sur 60-90 nm d'épaisseur. Des tranchants jetables en verre sont également utilisés car ils peuvent être réalisés en laboratoire et sont beaucoup moins chers.
• Métallisation : utilisation de métaux lourds comme le plomb, l'uranium ou le tungstène pour disperser les électrons d'imagerie et donc donner du contraste entre différentes structures, étant donné que de nombreux matériaux (notamment les biologiques), sont à peu près «transparents» aux électrons (objets à faible phase). En biologie, les spécimens peuvent être soit traités "en bloc" avant l'intégration, soit plus tard, après lamélisation. Généralement les fines tranches sont colorées pendant plusieurs minutes avec une solution aqueuse alcoolisée d'acétate d'uranyle, puis de citrate de plomb aqueux.
• Freeze-fracture ou gel-etch : mode de préparation particulièrement utile pour l'examen des membranes de lipides et des protéines intégrées en vue de face. Les tissus frais ou cellules en suspension sont congelés rapidement (cryofixed), puis fracturés par simple cassure ou à l'aide d'un microtome, tout en étant maintenus à la température de l'azote liquide. La surface froide fracturée (parfois «gravée» en augmentant la température à environ --100 °C pendant plusieurs minutes pour que la glace sublime) est ensuite contrastée avec des vapeur de platine ou d'or, à un angle moyen de 45° dans un évaporateur à vide. Une deuxième couche de carbone, pulvérisé perpendiculairement au plan moyen de la surface est souvent appliquée pour améliorer la stabilité du revêtement. Le spécimen est ramené à température et pression ambiante, puis la réplique métallique extrêmement fragile est détachée de la matière biologique sous-jacente par une délicate digestion chimique par des acides, une solution d'hypochlorite ou des détergents SDS. Le reste, encore flottant, est soigneusement lavé des résidus chimiques, soigneusement accroché sur les grilles du microscope, séché puis observé dans le MET.
• Ion Beam Milling : amincissement de l'échantillon jusqu'à ce qu'il soit transparent aux électrons par bombardement d'ions (en général d'argon) de la surface.
• Conductive Coating - ultrathin : Une couche de matériau conducteur électrique est déposée, soit par évaporation sous vide de haut en bas, soit par pulvérisation sous vide sur l'échantillon. Ceci est effectué pour éviter l'accumulation de champs électriques statiques dans l'échantillon, en raison de la nécessaires irradiation d'électrons au cours de l'imagerie. Ces couches comprennent de l'or, or/palladium, du platine, du tungstène, du graphite etc.. et sont particulièrement importantes pour l'étude des spécimens en microscopie électronique à balayage. Une autre raison d'appliquer un tel revêtement, même quand il y a assez de conductivité, est d'améliorer le contraste, ce que l'on fait plus couramment lors de l'utilisation d'un FESEM (émission de champ SEM). Quand de l'osmium est utilisé, il est possible d'appliquer une couche plus mince qu'avec l'un des revêtements mentionnés précédemment.