Le jeu s'ouvre sur un champ de bataille dévasté au Moyen-Orient. Solid Snake décrit en voix off la nature nouvelle de la guerre avec le passage de l'ère de la dissuasion à l'ère du contrôle. Régie par les nanomachines, la guerre est devenue une chose banale. La séquence se poursuit par un flashback. Trois jours plus tôt, Snake se recueille dans un cimetière quand un hélicoptère atterrit à proximité. Otacon vient à la rencontre de Snake dont le visage porte les stigmates d'un vieillissement accéléré. Il aborde avec lui le résultat de tests médicaux : Snake n'a plus qu'une année à vivre. Dans l'hélicoptère, il retrouve le colonel Roy Campbell qui travaille désormais au conseil de sécurité de l'ONU. Ses services ont localisé Liquid Ocelot au Moyen Orient : il se prépare à lever une insurrection. Campbell demande à Snake de se charger de l'assassiner.
Snake débute sa mission dans une ville du Moyen-Orient déchirée par une guerre entre une milice locale et la SMP Praying Mantis. Il retrouve le Metal Gear Mk.II, sorte de petit drone bipède qu'Otacon a développé pour assister Snake à distance. Le héros fait route vers le Palais Advent où il doit rencontrer les informateurs de l'US Marines : la Rat Patrol Team 01. L'équipe s'avère menée par Meryl Silverburgh, ancienne connaissance de Snake et fille du colonel Roy Campbell. En chemin, le héros fait la connaissance de Drebin, un vendeur d'armes piratées. Au sein du Palais Advent, la nouvelle équipe est attaquée par les Frogs, troupe d'élite et garde personnelle de Liquid Ocelot. Snake parvient ensuite à localiser Liquid dans un camp. Mais lorsqu'il s'apprête à l'éliminer, un étrange malaise s'empare de lui comme des dizaines de soldats présents sur place, les poussant à s'effondrer de chagrin et de remords ou à se battre entre eux. Liquid vient de faire une première tentative de piratage du système SOP. Snake reçoit une sérum des mains de Naomi Hunter, laquelle semble accompagner Liquid. Tandis que Liquid et Naomi s'échappent par hélicoptère, Akiba vient à la rescousse de Snake et l'emmène en sécurité.
Après être retourné au Nomad, avion servant de base à Snake et Otacon et abritant également la petite Sunny, Otacon découvre un message vidéo envoyé par Naomi Hunter. On y voit celle-ci détenue en otage en Amérique du Sud. Snake s'infiltre dans la région et y fait la rencontre du trafiquant d'armes Drebin, lequel révèle que les Patriotes sont désormais formé d'un réseau de cinq intelligences artificielles : GW (supposément détruit en 2009), TJ, TR et AL, qui sont opérationnelles sous la tutelle de l'IA centrale JD. Snake parvient à localiser Naomi et apprend que Liquid a besoin d'utiliser les informations génétiques de Big Boss pour accéder à JD. Naomi confirme que Snake n'a plus que quelques mois à vivre et lui apprend la mutation du virus FoxDie. À terme, le virus ne menace plus seulement les personnes pour lesquelles il a été programmé mais n'importe quel individu, transformant Snake en « arme de destruction massive ambulante ». Les choses se compliquent avec l'enlèvement de Naomi et l'arrivée des Frogs et de Laughing Octopus. Snake parvient à s'échapper avec Naomi et Drebin grâce à l'intervention de Raiden, métamorphosé en ninja cyborg, qui repousse les charges de plusieurs Gekkōs. Vamp et Raiden se livrent à une combat sanguinaire dont aucun ne sort vainqueur : Vamp blessé s'endort et Raiden gravement blessé a besoin d'une dialyse pour régénérer son sang artificiel.
À l'intérieur du Nomad, Naomi révèle que Big Boss est cliniquement vivant, du moins ses cellules, et que son cerveau est verrouillé par les nanomachines. Son corps est détenu par un groupe de rebelles nommé Paradise Lost localisé en Europe de l'Est. Leur leader, Big Mama, s'avère être EVA, et la mère porteuse de Solid Snake et Liquid Snake. Elle révèle également les origines des Patriotes, fondés par Major Zero quarante ans plus tôt. Suite à une attaque menée par Raging Raven, Snake et Eva s'échappent en moto, accompagnés par des vans visant à tromper la vigilance de leurs poursuivants. Au terme d'une course-poursuite à rebondissements, la moto s'écrase contre un mur et Eva est grièvement blessée. Cerné par l'armée volante de Raging Raven, Snake n'a d'autres choix que de l'affronter. Après le combat, il retourne récupérer Eva afin d'atteindre le fleuve Volta où un bateau (avec à bord le corps de Big Boss) les attend, mais celui-ci est détruit et c'est Liquid qui les y attendait. Cerné par l'armée américaine, Liquid fait montre de sa maîtrise du système SOP pour retourner la situation à son avantage : toutes les armes des soldats américains se retrouvent bloquées. Il jette le corps de Big Boss au feu, poussant Eva à se brûler gravement en essayant de sauver la dépouille. Snake tente alors d'aider Eva, mais le liquide à l'intérieur de la dépouille explose, causant à Snake une grave brûlure sur la joue gauche. Eva décède quelques minutes après dans les bras de son « fils ».
Le but final de Liquid est de détruire JD, l'IA centrale des Patriotes, afin de contrôler leur réseau avec GW, qu'il a apparemment réparé et maîtrisé après l'incident de Manhattan. Pour y parvenir, Liquid compte utiliser la seule arme de destruction massive qui échappe au contrôle des Patriotes, à savoir le canon à rampe du Metal Gear REX, l'objectif étant de lancer un missile nucléaire sur JD, abrité dans un satellite artificiel. Snake retourne alors à Shadow Moses pour empêcher Liquid de voler REX, dont le prototype est resté dans le hangar où ils s'étaient affrontés neuf années plus tôt. Après avoir vaincu Crying Wolf et un groupe de Frogs, il découvre que Liquid a déjà pris possession du canon à rampe. Il subit alors les attaques soudaines de Vamp jusqu'à l'arrivée de Raiden et d'une armée de Gekkōs. Deux combats simultanés s'engagent donc, l'un confrontant Snake à des Gekkōs kamikazes qui s'auto-détruisent, l'autre confrontant Raiden à un Vamp devenu mortel après que Snake lui a supprimé ses nanomachines. Naomi fait alors son apparition et achève Vamp avant de se suicider en supprimant ses propres nanomachines qui empêchait son cancer de se propager et de la tuer. Otacon réussit ensuite à réactiver REX à l'aide du Metal Gear Mk.III. Snake et Raiden s'en servent pour s'échapper, toujours sous l'assaut de plusieurs Gekkōs. Pendant que Raiden repousse les attaques de ces derniers, Snake utilise REX pour combattre un Metal Gear RAY piloté par Liquid. A la suite de la confrontation, Liquid lève le voile sur son arme ultime : un prototype d'Arsenal Gear qu'il a rebaptisé Outer Haven et dans lequel est installé le canon à rampe de REX. Il tente d'écraser un Snake mal au point avec l'énorme carcasse. Raiden, coincé sous des décombres après son combat contre les Gekkōs, se coupe le bras pour sauver Snake et stoppe la progression d'Outer Haven, s'infligeant au passage de graves blessures. Outer Haven se redirige enfin vers la position d'où il pourra lancer son attaque nucléaire.
À bord de l'USS Missouri, ancien navire de guerre échappant au système SOP, Mei Ling tente de rattraper Outer Haven et d'y envoyer Snake, Meryl et Johnny. Leur but est d'accéder à la salle des serveurs renfermant le système GW et d'y introduire un virus informatique conçu par Naomi et Sunny pour stopper la frappe nucléaire sur JD. Sur le chemin, Snake croise la route de Screaming Mantis et l'affronte. À la suite du combat, il est contraint de laisser Meryl, Johnny et Raiden face aux Frogs et d'avancer seul vers la salle des serveurs. Il traverse alors un long couloir truffé de micro-ondes qui lui causent de graves brûlures, mais parvient néanmoins à accéder à l'antre de GW. Mal en point, il subit l'assaut de Gekkos nains pendant que le Mk. III charge le virus dans GW. Le ver informatique détruit alors non seulement GW mais également l'ensemble des IA constituant les Patriotes, désactivant au passage tous les systèmes de défense des troupes de Liquid.
Les Marines prennent le contrôle d'Outer Haven, alors que Snake, affaibli, attend l'arrivée des secours sur le toit de la forteresse. C'est à ce moment que Liquid Ocelot arrive et révèle ses véritables intentions. Tout ce que Snake a entrepris et réussi a été préparé et encadré par Liquid. Celui-ci affirme que son intention d'utiliser la canon à rampe du Metal Gear Rex n'était qu'un leurre pour que les Patriotes ne puissent pas soupçonner les tentatives de Snake de détruire leur système, alors qu'eux-mêmes prévoyaient que Snake stoppe Liquid pour avoir ainsi le contrôle total. Après cette révélation, Snake et Liquid Ocelot s'engagent dans un combat final à mains nues, que Snake remporte.
L'épilogue débute par le mariage de Johnny et Meryl sur une piste d'atterrissage, auquel assistent les membres de la Rat Patrol, Otacon, Sunny, Drebin et Roy Campbell, finalement réconcilié avec sa fille. De son côté, Raiden voit son enveloppe cybernétique remplacée par un tissu organique grâce à la chirurgie. Il finit également par se réconcilier avec Rose et découvre son fils John. La fausse-couche de Rose ainsi que sa relation avec Campbell n'étaient que des leurres visant à protéger leur enfant des Patriotes pendant la mission de Raiden. Snake se recueille sur les tombes de The Boss et de Big Boss puis s'apprête à se suicider afin de stopper la mutation de FoxDie et éviter qu'il ne se transforme en arme de destruction massive ambulante. Ce suicide est, selon ses propres mots, sa « dernière mission ». Au même moment, Drebin révèle à Otacon qu'il a aidé Snake sur ordre des Patriotes. Il révèle également que la Rat Patrol Team 01 était manipulée par les Patriotes (RAT PT 01 étant un anagramme du mot Patriot).
Après le début du générique de fin, le joueur découvre que Snake n'a pas réussi à se suicider. Aux abords du cimetière, une voix distincte et jusqu'ici inconnue approuve Snake de s'être épargné la vie. Cette voix est celle de Big Boss. Ce dernier confie à Snake que le corps brûlé sur le fleuve Volta était celui de Solidus Snake, et que lui-même a été reconstitué grâce à des fragments provenant des corps de Liquid Snake et de Solidus Snake. Big Boss n'est pas venu seul, il est accompagné de Zero, sur chaise roulante à l'état végétatif en raison de son âge avancé. Big Boss fait lumière sur les motivations de Zero lors de la création des Patriotes, avant de couper le respirateur qui le maintient en vie. Il révèle qu'Ocelot et Eva avaient quitté les Patriotes, et que leur but était depuis lors de les détruire. Snake apprend également qu'Ocelot utilisait en effet l'auto-suggestion et ses nanomachines pour se transformer en double de Liquid pour tromper les Patriotes. Sa mort ainsi que celle d'Eva sont dues à une nouvelle version de FoxDie, que Drebin a injecté à Snake au . Cette nouvelle version a non seulement supplanté l'ancienne, mais elle commence déjà à ronger le corps de Big Boss. Le père et le fils font alors la paix, puis Big Boss salue une dernière fois la tombe de son ancien mentor, The Boss, avant de s'éteindre.
La plupart des personnages des deux premiers épisodes sont de retour :