Immunoprécipitation - Définition

Différentes méthodes

Les deux méthodes les plus courantes pour l'immunoprécipitation sont la « capture directe » et la « capture indirecte ».

Capture directe

Les anticorps spécifiques d'une certaine protéine (ou d'un groupe de protéines) sont immobilisés sur un substrat en phase solide comme des billes superparamagnétiques microscopiques ou des billes d'agar-agar microscopiques (non–magnétiques). Les billes et les anticorps sont alors ajoutées au mélange de protéines, et les protéines correspondant aux anticorps sont capturées, via les anticorps, sur les billes (c'est-à-dire « immunoprécipitées »).

Capture indirecte

Les anticorps spécifiques d'une certaine protéine, ou d'un groupe de protéines, sont ajoutés directement au mélange de protéines. Les anticorps n'ont pas encore été attachés à un support en phase solide et restent donc libres de flotter dans le mélange de protéines pour aller se fixer sur leurs « cibles ». Au fur et à mesure, on ajoute les billes enrobées de protéines A/G au mélange d'anticorps et de protéines. À ce stade, les anticorps qui sont maintenant liés aux protéines qui leurs correspondent vont s'agglutiner sur les billes.
À partir de cette étape, les méthodes par capture directe et indirecte se rejoignent car nous sommes en présence de mélanges contenant les mêmes ingrédients. Les deux protocoles donnent les mêmes résultats au final avec des protéines, ou des complexes de protéines, liées aux anticorps, eux-mêmes fixés sur les billes.

Sélection

Parfois, on privilégie l'approche indirecte lorsque que, soit la concentration de la protéine étudiée, soit l'affinité spécifique de l'anticorps utilisé, sont faibles. La méthode indirecte est aussi appréciable lorsque la vitesse de liaison de l'anticorps et de la protéine est lente. À ces exceptions près, la méthode directe est le meilleur choix dans la plupart des cas.

Mode opératoire

Vue d'ensemble

Une fois que le support solide a été choisi, les anticorps sont liés aux billes et les billes enrobées d'anticorps sont introduites dans un échantillon mélangé de protéines. À ce stade, les anticorps qui sont collés aux billes vont se lier aux protéines qui sont reconnues spécifiquement. L'immunoprécipitation proprement dite est alors terminée : les protéines que l'on cherchait à isoler sont collées aux anticorps qui sont eux–mêmes collés aux billes. La seule chose qui reste à faire est de séparer physiquement les billes (avec les anticorps et les protéines liés) du reste de l'échantillon, ensuite les billes seront lavées pour éliminer les protéines non spécifiques.

Avec les billes superparamagnétiques, l'échantillon est placé dans un champ magnétique, ainsi les billes se rassemblent sur les bords du tube. Ce processus prend environ 30 secondes et le liquide restant non désiré est prélevé à la pipette. Les lavages s'effectuent en remettant les billes en suspension hors du champ magnétique, puis les billes sont à nouveau rassemblées sur les bords du tube dans le champ magnétique. On répète cette étape du lavage pour s'assurer de l'élimination des éléments indésirables. Si les billes sont uniformes en taille et l'aimant conçu convenablement, les billes se rassemblent uniformément sur les bords du tube et la solution de lavage pourra être enlevée en totalité.

Lorsqu'on travaille avec des billes d'agar–agar les billes doivent être extraites de l'échantillon et agglomérées au cours d'une rapide centrifugation de l'ordre de 600 à 3 000 g (le « g » est une unité d'accélération). Cette étape peut-être réalisée dans un microtube à centrifuger classique, mais pour aller plus vite et pour être plus efficace on préfère souvent employer une colonne à centrifuger dont la taille des pores laisse passer le liquide mais retient les billes. En fin de centrifugation, les billes agglomérées forment une mince pellicule dans le fond du tube. La partie surnageante contenant les éléments non désirés peut alors être ôtée avec précaution pour ne pas mélanger les billes d'agar–agar. La solution tampon peut alors être additionnée, mélangée, et les billes sont à nouveau agglomérées par centrifugation.

À la suite de la première capture des protéines ou du complexe de protéines étudiés, quelle que soit la nature des billes utilisées, le support solide est lavé à plusieurs reprises pour éliminer toutes les protéines non spécifiques et celles qui sont mal liées au support par l'intermédiaire de l'anticorps. Après les différentes phases de lavage, les protéines précipitées sont éluées et analysées selon la méthode de l'électrophorèse sur gel, de la spectrométrie de masse ou du western blot, ou par de nombreuses autres méthodes permettant d'identifier les constituants du complexe. Si bien que la co–immunoprécipitation s'impose comme la méthode standard pour évaluer les interactions protéine–protéine.

La durée du processus d'immunoprécipitation varie dans une large mesure en raison de nombreux facteurs. La duréee augmente, par exemple, avec le nombre de lavages nécessaires ou encore si la vitesse de réaction sur les bille poreuses est faible. La grande majorité des immunoprécipitation s'effectue avec des billes d'agar–agar; l'usage des billes magnétiques est beaucoup plus récent et commence seulement à gagner en popularité.

Différentes étapes

1. Lyser les cellules et préparer l'échantillon pour l'immunoprécipitation ;
2. faire une présélection en faisant passer l'échantillon sur des billes non enrobées d'anticorps pour absorber les protéines qui ne sont pas spécifiquement liées aux billes ;
3. incuber la solution avec des anticorps spécifiques des protéines étudiées. Les anticorps peuvent être, soit liés au support solide avant cette étape, c'est la méthode directe, soit après, c'est la méthode indirecte. Poursuivre l'incubation pour permettre aux complexes anticorps–antigène de se former ;
4. précipiter le complexe étudié et l'extraire du substrat ;
5. laver plusieurs fois le complexe. Effectuer une centrifugation entre chaque lavage, ou placer le tube sur un aimant dans le cas de billes superparamagnétiques, et ôter la partie surnageante. Après le dernier lavage, retirer le plus de surnageant possible ;
6. éluer les protéines du support solide avec un tampon de faible pH ou du laurylsulfate de sodium ;
7. faire l'analyse des complexes ou des antigènes étudiés. Il existe différentes manières de procéder :
   1. électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium suivi d'une coloration du gel ;
   2. électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium suivi d'une coloration du gel, puis découpage des bandes de protéines colorées une à une et séquençage des protéines sur les bandes par spectrométrie de masse – désorption-ionisation laser assistée par matrice ;
   3. transfert et western blot par l'utilisation d'un autre anticorps pour les protéines ayant interagi avec l'antigène, puis détection par chimiluminescence.