Sa couleur étant visible même à faible dose, la fluorescéine est utilisée pour tracer les cours d'eau souterrains, des résurgences, des fuites, etc.
De la même façon, la fluorescéine est utilisée pour les tests sur les réseaux d'eaux usées, pour retrouver le cheminement de réseaux mal connus, identifier les inversions entre réseaux d'eaux usées et pluviales, etc.
Les usines géothermiques utilisent la fluorescéine pour suivre la propagation des courants d'eau chaude expulsés dans la mer. L'usine géothermique de Bouillante en Guadeloupe utilise cet élément pour vérifier que des sources d'eau chaude détectées en bord de mer sont bien naturelles et non des eaux réchauffées par la sortie de l'usine toute proche.
Elle permet de détecter la présence de fuite sur des circuits hydrauliques (huile et carburant) complexes, notamment sur les engins à transmission hydraulique (vérin, raccord...).
Elle est aussi utilisée dans certains médicaments (ex. : éosine), et en biologie moléculaire comme pour la confection de sondes pour les hybridations in situ en fluorescence (ou FISH), la PCR en temps réel et l'hybridation génomique comparative.
Elle était utilisée en injection 20 %, pour les angiographies du fond de l'œil en fluorescence, mais en juin 2002, l'Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé a imposé en accord avec le fabricant la suspension de l'AMM de cette spécialité et le retrait de tous les lots de solution injectable de Fluorescéine Sodique FAURE à 20%, en raison de réactions d'hypersensibilité sévères plus fréquentes avec la fluorescéine à 20% qu'avec la fluorescéine à 10% (qui reste autorisée).
Au 1er octobre 2004, 23 cas d'effets indésirables graves ont été signalés en France dont 5 cas conclus par la mort du patient ont été notifiés en France avec AK-Fluor® qui remplace la Fluorescéine Sodique Faure 10%, en rupture de stock, du fait de difficultés de fabrication, selon l'afssaps. Les effets secondaires bénins sont (isolés ou associés) :
Des effets plus graves peuvent parfois suivre ces symptômes mineurs d'allergie, dans les minutes ou heures suivant l'injection :
et plus rarement :
Une réaction inflammatoire et douleur locale peuvent résulter d'une diffusion du produit hors de la veine durant l'injection. Les conjonctives, la peau et les urines sont temporairement jaune fluorescent quelques heures après l'examen.
On l'utilise également lors de l'examen de la cornée pour visualiser les abrasions.
La fluorescéine sert de donneur dans la confection de sondes de PCR en temps réel.
Elle est également utilisée comme moyen de signalisation de secours facilement transportable sur des embarcations de navigation. En cas de nécessité, la tache formée par le produit facilite grandement la détection aérienne, notamment pour des petites embarcations (kayak de mer, etc...)