Chromatographie - Définition

Principe

La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous par une phase mobile à travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes espèces moléculaires et la phase stationnaire.

Les différents composants de l'échantillon ont généralement une vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase mobile et de la phase stationnaire.

Souvent, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà connues dans l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de l'analyse d'une solution-étalon (solution commerciale contenant des substances connues, à des concentrations bien connues). Ces substances servent de références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par comparaison des vitesses de séparation (et éventuellement d'autres renseignements donnés par la détection). Il s'agit de chromatographie analytique.

Dans d'autres cas, on se contente de séparer les fractions, de les récolter pour les identifier par d'autres techniques: c'est la chromatographie préparative.

Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les classer selon la nature de la phase mobile :

• la chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ;
• la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais) également appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ;
• la chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ;
• la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou HPLC en anglais) ;
• la chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais).

On peut aussi les nommer selon les interactions développées par la phase stationnaire :

• la chromatographie d'adsorption/d'affinité ;
• la chromatographie de partage ;
• la chromatographie à échange d'ions ;
• la chromatographie chirale (qui est, soit de la CPG, soit de la CPL) ;
• la chromatographie d'exclusion stérique (CES ou SEC en anglais) ;

Ou selon le support de la phase stationnaire :

• la chromatographie sur colonne (regroupant notamment HPLC et CPG) : la phase stationnaire est dans un tube étroit et la phase mobile progresse par gravité ou différence de pression ;
• la chromatographie planaire (qui recouvre CCM et chromatographie sur papier) : la phase stationnaire est sur la surface d'un support plat (CCM) ou dans une feuille de cellulose poreuse (chromatographie papier) et la phase mobile se déplace par capillarité ou par gravité.

Enfin, un nouveau type de chromatographie commence à trouver des applications : la chromatographie à 2 dimensions.

Grandeurs caractéristiques en analyse chromatographique sur colonne

Vitesses de déplacement des solutés

Le pouvoir séparateur d’une colonne est fonction des vitesses relatives d’élution. Ces vitesses sont donc fonction du coefficient de distribution des solutés entre les 2 phases :

Coefficient de distribution :

où C_S est la concentration du soluté en phase stationnaire et C_M la concentration du soluté en phase mobile.

Temps de rétention t_R : temps qui s’écoule entre l’injection de l’échantillon et l’apparition d’un pic de soluté sur le détecteur d’une colonne chromatographique.

Temps mort t_M : temps nécessaire pour qu’une espèce non retenue par la phase stationnaire traverse la colonne.

Vitesse linéaire moyenne de déplacement du soluté :

où L est la longueur de la colonne.

Vitesse linéaire moyenne de la phase mobile :

Relation entre vitesse de déplacement et coefficient de distribution :

où V_S et V_M sont les volumes de solutés respectivement dans la phase stationnaire et mobile (aussi appelé volume mort), or ces volumes sont proportionnels aux volumes des 2 phases respectivement, ils peuvent donc être estimés si on connaît la structure géométrique de la colonne.

Temps réduit t'_R :

t'_R = t_R − t_M

Volume réduit V'_R :

V'_R = V_R − V_M

Débit D :

Certains paramètres qui affectent les vitesses relatives des analytes peuvent être modifiés :

• Vitesse linéaire de la phase mobile
• Coefficient de diffusion dans la phase mobile
• Coefficient de diffusion dans la phase stationnaire
• Facteur de capacité k’
• Diamètre des particules support
• Epaisseur de la couche liquide sur la phase stationnaire

Facteur de capacité

Facteur de capacité k' : paramètre expérimental important permettant de décrire la vitesse de progression des solutés dans les colonnes. C’est le rapport des quantités d’un analyte présentes à l’équilibre dans les 2 volumes de phase stationnaire et mobile adjacentes. Le facteur de capacité depend de la température (CPG), du remplissage de la colonne (CPG), de la composition de la phase mobile et stationnaire (HPLC)...

• k'<1 : élution trop rapide
• 1
• 5

Facteur de sélectivité α : rapport du coefficient de distribution du soluté qui est retenu le plus sur le coefficient de distribution du soluté qui est retenu le moins. Le facteur de sélectivité de deux analytes permet d’estimer à quel point la colonne peut les séparer. Il est donc utilisé pour calculer le pouvoir séparateur d’une colonne. α>1 toujours.

Élargissement des bandes et efficacité d'une colonne

L’efficacité d’une colonne dépend du degré d’élargissement du pic qui se produit à mesure que l’analyte parcourt la colonne. Cet élargissement dépend du temps de séjour de l’analyte dans les 2 phases :

• t_R grand : pics larges ;
• t_R petit : pics fins.

L’efficacité d’une colonne s’évalue à partir de l’un ou l’autre de ces deux termes :

• H = hauteur équivalente à un plateau théorique
• N = nombre de plateaux théoriques

L’efficacité augmente quand N augmente ou quand H diminue à L constante. σ est la variance, ω est la largeur de la base du pic, δ la largeur du pic à mi-hauteur :

et ou

L’importance des effets cinétiques sur l’efficacité de la colonne dépend essentiellement de la durée de contact entre la phase mobile et la phase stationnaire, dépendant elle-même de la vitesse d’écoulement de la phase mobile. L’élargissement des pics est minimisé en réduisant la granulométrie du matériau de remplissage et le diamètre de la colonne. En effet la phase stationnaire est granulée et le solvant occupe le volume des interstices, ce volume est appelé volume mort de solvant. H augmente avec ce volume et diminue avec le diamètre de la colonne.

Résolution de la colonne

La résolution R_S d'une colonne est la mesure quantitative de son aptitude à séparer deux analytes A et B :

• Si R_S > 1,5 : séparation complète de A et B
• Si  : séparation incomplète de A et B
• Si R_S < 0,75 : analytes A et B mal séparés

Remarque : une résolution de 1,5 correspond à un recouvrement des pics de 1%.

Lien entre résolution et nombre de plateaux théoriques :

Cette relation permet de remarquer que la résolution R_S d'une colonne est proportionnelle à la racine carrée de sa longueur car le nombre de pics théoriques N est proportionnel à la longueur L de la colonne. Avec une phase stationnaire donnée on peut améliorer la résolution de la colonne en augmentant le nombre de plateaux théoriques donc en augmentant la longueur de la colonne. Mais ceci augmente la durée de l’analyse, un compromis est donc nécessaire.

Méthodes d'optimisation

• Modification de la hauteur équivalent à un plateau théorique (diamètre colonne, granulométrie…)
• Modification du facteur de capacité (composition phase mobile, température, solvant…)
• Modification du facteur de sélectivité (composition phase mobile, température colonne, composition phase stationnaire, effets chimiques (complexes…)