Étant donné leur mode de vie, les chiroptères comptent peu de prédateurs.
En Europe, ils sont occasionnellement la proie de chouette, de hibou, de faucon, de rat et de chat. Leurs pires ennemis sont les parasites. Leurs ailes, avec les nombreux vaisseaux sanguins, sont une source de nourriture idéale pour les tiques et les puces. Les serpents sont fréquents dans leurs dortoirs collectifs souterrains, sans doute comme prédateurs (à moins qu'ils hibernent dans les mêmes conditions).
En Afrique, dans beaucoup de régions, la roussette est pour l'homme un gibier et un plat de choix.
L'université de Floride (Gainesville) était envahie par les moustiques. En septembre 1991, une bat house capable d'accueillir 200,000 chauve-souris fut construite avec toit de lattes et de bonnes conditions de température et de circulation d'air, et laissé à la colonisation naturelle après un premier essai de transfert resté infructueux.
Au printemps, 18 mâles s'installèrent, suivi par 300 autres mâles dans l'année; il s'agissait de molosses du Brésil. Au printemps 1995, arrivèrent plus de 1000 femelles qui donnèrent naissance à des centaines de petites chauves-souris. En mai 1998, à peu près 70,000 chiroptères peuplaient la bat house, consommant chaque nuit quelques 60 millions d'insectes réputés nuisibles, ce qui permit de ne plus utiliser le moindre produit chimique et donc de faire d'importantes économies.
Cette population de chauve-souris attira de nombreux hiboux et faucons, mais aussi de nombreux guetteurs humains, amateurs de chiroptères et d'oiseaux. Quelques années plus tard, l'expérience fut reconduite avec une autre bat house du côté du lac Alice.
Les chauves-souris pourraient être au moins aussi importantes que les oiseaux dans la régulation des populations d'insectes en milieu tropical. Deux équipes indépendantes ont démontré que certaines espèces d'insectes nuisibles proliféreraient si elles n'étaient pas traquées la nuit par les chauves-souris.
Les espèces de mégachiroptères se nourrissant de nectar sont d'excellents pollinisateurs, d'autres disséminent les graines par l'intermédiaire des déjections en vol.
Certaines espèces d'arbres comme un baobab du genre Adansonia ou bien les arbres à saucisses forment même une interaction mutualiste avec les chauves-souris. Leurs grosses fleurs, à l'odeur nauséabonde pour l'homme, s'épanouissent la nuit et pendent sur le chemin des pollinisateurs.
Comme de nombreux petits mammifères, certaines espèces peuvent être le vecteur de virus et zoonoses.
Cela a été démontré pour le virus Ébola qui serait transmis accidentellement par certaines chauve-souris africaines.
Quelques espèces de chauve-souris des régions tropicales, de la familles des Desmodontinae et dites « vampires », peuvent dans de très rares cas sucer le sang humain durant leur sommeil. Dans ces régions à risque, l'usage d'une moustiquaire suffit pour s'en protéger ainsi que des infections qu'elles pourraient transmettre.
Il est vrai que des chauves-souris malades sont susceptibles, comme d'autres animaux sauvages, de transmettre par simple léchage ou griffure des virus graves, notamment celui de la rage qui pousse parfois les animaux contaminés à mordre quand ils sont à un stade avancé de la maladie. En Europe le risque est minime : en un peu plus d'un quart de siècle, seules 8 personnes ont été ainsi contaminées entre 1977 et 2003 (3 en Ukraine, 2 en Russie, 1 en Finlande, 1 en Lettonie et 1 en Angleterre).
Il est donc possible, mais rare, qu'un humain contracte la rage de la chauve-souris (attention ce n'est pas la même rage que celle du chien) et cette maladie n'est mortelle pour l'homme que si aucun traitement n'est entrepris rapidement.
C'est pour ces raisons que, par prudence, il est déconseillé de toucher une chauve-souris, surtout si elle présente un comportement anormal, se laisse approcher ou vole difficilement. Il convient de la laisser s'échapper seule ou bien de faire intervenir un service compétent pour la soigner. Le cadavre d'un animal retrouvé mort doit être analysé par un laboratoire spécialisé qui viendra le prendre.