La cinématique d'introduction montre le prototype de protecteur delta incarné par le joueur défendre sa petite sœur nommée Eleanor Lamb contre des Chrosômes qui veulent prendre son ADAM. Des liens forts se sont apparemment tissés entre eux, à tel point que la petite fille appelle le protecteur "papa". Mais le docteur en psychologie Sofia Lamb - la mère de l'enfant - intervient et ordonne au protecteur (ayant été soumis au pouvoir du plasmide Hypnose envoyé durant le combat) de se tirer une balle dans la tempe. Le jeu commence 10 ans plus tard, en 1968, quand le joueur se réveille près d'une vita-chambre. Après avoir découvert le plasmide Arc électrique et réactivé le générateur, il est contacté par le Dr. Tanenbaum qui désire l'aider à retrouver Eleanor (devenue une jeune fille) qui est prisonnière du Dr Lamb, la nouvelle dirigeante de Rapture. Très vite, le joueur devra affronter une Big Sister, sorte de femme protecteur très agile, au service de Lamb. Il est également repéré par cette dernière, qui n'aura de cesse de lui mettre des bâtons dans les roues jusqu'à la fin de l'aventure. Tanenbaum décide alors de s'échapper en emmenant ses protégées, et demande au joueur de prendre contact avec Augustus Sinclair, un avocat, homme d'affaires et escroc venu à Rapture pour faire fortune et impliqué dans de nombreuses activités parfois illégales (Il fournit par exemple des cobayes humains kidnappés pour les scientifiques de Rapture, qui manquaient de volontaires pour leurs expériences sur les plasmides et l'ADAM). C'est alors Sinclair qui va guider le joueur pendant tout le reste du jeu. Eleanor intervient régulièrement en utilisant son lien avec les petites sœurs afin de livrer des colis et des messages à travers Rapture à Delta.
Au cours de son périple pour retrouver Eleanor, le joueur est confronté à plusieurs personnages liés à son histoire personnelle dont il peut décider s'il va les tuer ou non. De plus, comme dans le premier épisode, il est possible de choisir soit de sauver ou de récolter les petites sœurs qu'il rencontre. Les choix du joueur influeront directement sur la deuxième partie du jeu.
D'après les messages audio disséminées à travers Rapture, on découvre que Le Dr. Lamb a été amenée à Rapture afin d'aider ceux qui avaient des difficultés à faire face à la vie sous-marine. Cependant, Lamb utilisa ses séances de thérapies pour laver le cerveau de ses patients afin qu'il rejoigne une secte "La Famille". Plus tard, Lamb fut confronté à Ryan où il fut battu durant des débats publiques, les idéaux collectivistes de Lamb entrant directement en conflit avec l'individualisme et l'anti-altruisme de Ryan. Contre cette nouvelle menace, Ryan demanda à Sinclair de "s'occuper" d'elle. Sinclair envoya un espion, Stanley Poole, au sein de La Famille afin de piéger Lamb, en la faisant passer pour une communiste. Celle-ci fut arrêtée et emprisonnée, laissant sa fille Eleanor au soin de son fidèle bras droit, Grace Holloway. Le joueur devra faire face à Holloway au cours de son aventure.
Eleanor se confronta à Stanley Poole, ayant pris la direction du Parc Dionysos, à propos de la façon dont il ruine la fortune de Lamb en organisant des réceptions démentes, menaçant de tout révéler à sa mère. Celui-ci paniqua et enleva la fillette qui se retrouva dans un des orphelinats de Frank Fontaine, qui fournissait secrètement des sujets pour les expériences sur les Petites Sœurs, finissant par la transformer en une d'elle. Stanley est également responsable du massacre d'une bonne partie des proches de Lamb qu'il a noyé en inondant le Parc Dionysos, craignant qu'ils ne le dénoncent à Lamb lorsque celle-ci sortirait de prison.
On découvre également la véritable identité de Delta et son passé : Pierrot L'Enclume. Ayant découvert tout seul Rapture par exploration sous scaphandre, il fut joyeusement accueilli par ses habitants qui le surnommèrent ainsi. Ryan, craignant que celui-ci ne soit un espion, demanda à Sinclair de se débarrasser de lui. C'est cette situation qui mena à la transformation de Pierrot en Protecteur. Les protecteurs étaient d'anciens cobayes, qui lorsque leur ADN ne pouvait plus supporter d'injections d'ADAM supplémentaires, se faisaient laver le cerveau et mettre en combinaison de protecteur. Delta a été le seul à avoir tenu si longtemps sans sombrer dans la démence.
On rencontre également Gilbert Alexandre, un scientifique spécialisé en ingénierie mécanique et robotique. Après la saisie de Fontaine Industries par Ryan Industries, il devint le maître des lieux. C'est lui qui est à l'origine de la majorité des systèmes de sécurité de Rapture et du projet Delta. À la mort de Fontaine et de Ryan, il eut son rôle dans la chute de la cité : transformation d'Eleanor en Petite Sœur, création de Delta, des Big Sisters, etc. Rongé par le remord, il fut alors enrôlé par Lamb qui le manipula pour l'utiliser dans ses expériences sur l'ADAM. Lorsque le joueur arrive à Fontaine Industries, des messages laissés par Gilbert une année auparavant racontent son histoire. Celui-ci désire que le joueur tue l'abominable créature qu'il va devenir : Alexandre Le Grand.
Delta découvre que Lamb planifie d'utiliser l'ADAM - qui absorbe les souvenirs de tous ceux qui l'utilisent - pour transformer sa fille en une super-humaine ayant toute la connaissance des élites intellectuelles de Rapture, croyant que celle-ci pourra ainsi incarner le prophète ultime du culte utopiste de La Famille. Lamb utilisera alors la même méthode de conditionnement utilisé sur Jack Ryan dans Bioshock par le Dr. Suchong (le programme de suggestion coercitive : JVP) afin de détruire comme elle l'appelle "la conscience de soi" d'Eleanor, et de la façonner de manière à ce qu'elle agisse de façon à soutenir "l'intérêt général" sans se poser de question afin de "sauver le monde".
On découvre également les plans de Sinclair : ayant compris la chute de la cité, il planifie de reprendre le contrôle de Rapture à Lamb et de remonter à la surface afin de vendre la technologie rapturienne aux plus offrants, raison qui le pousse à aider Delta.
Lorsque le joueur finit par trouver Eleanor, il voit le Dr Lamb étouffer la jeune fille, ce qui le fait sombrer dans le coma à cause du lien entre lui et Eleanor. Notre Big Daddy est un prototype dont le lien entre lui et sa Little sister est symbiotique. Si la Petite Sœur meurt, celui-ci meurt également. Le cœur d'Eleanor s'est donc arrêté juste assez pour que le lien soit brisé. Il se réveille alors enchaîné à une table. Malgré le fait que d'une certaine manière il est mort, il aura juste assez de temps pour survivre jusqu'à la fin du jeu. Eleanor le contacte par télépathie et lui permet de prendre le contrôle d'une petite sœur. Le joueur peut alors se déplacer dans Rapture à l'aide des manches à air et découvre la ville comme la voient les petites sœurs : de manière idyllique. Le joueur peut néanmoins voir la vraie ville lors de quelques flashs ou lorsque la Petite Sœur récolte de l'ADAM. Durant ce temps, les paroles et l'interprétation d'Eleanor, de Lamb et Sinclair diffèrent selon vos actions passées jusqu'à la fin du jeu. (par exemple, si on récolte les Petites Sœurs, il dit de tuer Eleanor pour notre survie. Inversement, il nous dit la sauver et de l'emmener avec nous)
Le joueur, grâce à la petite sœur qu'il contrôle, doit amener à Eleanor une tenue de Big Sister. S'ensuit un monologue de la jeune fille qui explique que c'est elle qui a demandé à une petite sœur de ressusciter à la vita-chambre du début grâce à l'aide du Dr Tenenbaum et qu'elle surveillait les agissements de son "père" (le joueur) et qu'elle va s'en inspirer. Si le joueur a suivi une "mauvaise" voie (récolter les petites sœurs, tuer les personnages à sa merci), Eleanor récolte immédiatement la petite sœur qui lui a amené sa tenue. Elle va ensuite délivrer le joueur, enfermé non loin de là.
Le joueur et Eleanor ont alors pour objectif de s'échapper de Rapture pour remonter à la surface, mais le Dr Lamb bloque le bathyscaphe de Sinclair en détruisant les compresseurs du ballast. Eleanor décide alors de faire bouillir l'eau pour vider le ballast. Pour cela, elle aura besoin de beaucoup d'ADAM ou des petites sœurs, et se dirige vers l'orphelinat pour récolter ou sauver toutes les petites sœurs qui s'y trouvent. Entre-temps, le joueur devra affronter et tuer Sinclair, celui-ci ayant été transformé en Alpha par le Dr. Lamb. Essayant en vain de résister à la soumission, il vous supplie de le tuer afin de lui épargner une telle situation. Vous récupérez ainsi la clé principale. Mais lorsque les deux protagonistes se dirigent vers le bathyscaphe, des explosifs détruisent toute la zone. Eleanor se téléporte et vous vous accrochez au bathyscaphe qui remonte.
Deux cinématiques sont possibles durant la remontée du bathyscaphe où Eleanor noie ou sauve sa mère, le Dr. Lamb. Ce fait influence également la détermination de la cinématique de fin.
S'ensuit l'une des cinématiques de fin possibles selon les choix effectués durant le jeu.
Il existe de nombreuses fins qu'il faut séparer en deux phases.
Les "mauvaises" fins :
Les fins "neutres" :
Si vous avez sauvé ou récolté des petites soeurs, alors vous avez accès à la fin neutre du jeu. Dans la fin neutre, Eleanor hésite et laisse le choix à son père de décider si elle peut l'absorber. Ce choix ajouté au destin des personnages-clés donne une large gamme de fins différentes.
Notez qu'il n'existe qu'une seule vraie fin neutre dans le jeu. En effet si vous décidez de survivre à travers Eleanor, la fin neutre devient automatiquement une mauvaise fin.
Les "bonnes" fin :