Microscope à fluorescence - Définition

La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'emettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus forte énergie (plus courte longueur d'onde).

Depuis la découverte du phénomène au début du XX^e siècle, de nombreuses applications ont vu le jour dans des domaines variés des sciences et techniques. Ainsi la microscopie optique va permettre de déceler la présence de divers composés par l'observation de la fluorescence.

La microscopie en fluorescence fait désormais partie des méthodes de recherche utilisées de manière routinière.

Principe de la microscopie en fluorescence

La luminescence est un procédé qui peut se scinder en 2 grandes catégories : la fluorescence et la phosphorescence.

Un objet éclairé émet de la lumière dans toutes les directions de l'espace à une longueur d'onde différente de la longueur d'onde excitatrice. Pour une substance donnée si l'émission de la lumière cesse dès l'arrêt de l'excitation alors on la dit fluorescente, si cette émission continue alors la substance est phosphorescente.

En fluorescence on distingue deux types d'objets : les premiers émettent de la lumière fluorescente par eux-mêmes, on parle de fluorescence primaire ou autofluorescence (chlorophylle, huile...), les autres doivent être combinés à une substance fluorescente pour émettre de la fluorescence on parle donc de fluorescence secondaire.
En microscopie de fluorescence on peut visualiser des substances, des cellules, des molécules non fluorescentes en les marquant avec des fluorochromes (le DAPI marque l'ADN qui fluoresce en bleu).
Certains marqueurs génétiques comme la protéine fluorescente verte, (en anglais Green Fluorescent Protein ou GFP) sont aussi très utilisés en biologie. Dans ce cas, le fluorochrome est une protéine produite directement par la cellule elle-même et ne nécessite pas l'ajout de substrat, la fluorescence peut alors être visualisée directement dans les cellules vivantes.

Historique de la microscopie de fluorescence

Voir aussi l'article Fluorescence pour l'historique de la fluorescence elle-même.

Différents types de microscopes

Le microscope est un outil d'observation qui a vu le jour au XVII^e siècle. Le microscope optique traditionnel, le microscope électronique à balayage, le microscope électronique à transmission, le microscope optique de fluorescence, le confocal sont maintenant utilisés en routine dans de nombreux laboratoires.
Le microscope de fluorescence est construit de façon à produire un rayonnement de fluorescence et l'observer. En microscopie de fluorescence, on utilise l'informatique pour traiter les images (déconvolution).

En l'absence de méthode permettant de limiter l'observation des fluorophores à un plan focal (TIRFM, Microscope confocal à balayage laser ou microscopie multiphotons), on parlera de microscopie à épifluorescence.

Limites du microscope optique : Limite l'utilisation de la microscopie en fluorescence pour l'étude des interactions protéines-protéines

Due au fait que le microscope optique utilise la lumière pour obtenir une image agrandie d'un objet fait qu'il devient inefficace à partir d'une certaine échelle. En effet, la lumière est un ensemble de couleur ayant chacune une longueur d'onde spécifique. La plus petite longueur d'onde des couleurs visibles est celle du violet qui est de 400 nm.

La limite de résolution en microscopie optique est fixée par le critère de Rayleigh qui énonce que deux points ne peuvent être séparés que s'ils sont distants de au moins de la longueur d'onde divisée par 2.

Cette limite de résolution, appelée pouvoir de résolution, est donc de 200nm environ en microscopie optique classique. La microscopie en champ proche optique à balayage (SNOM: Scanning Near-field Microscopy) est l'alternative. Ce type de microscope est fondé sur l'emploi d'une sonde de taille nanomètrique (de 50 à 100nm) servant de nanosource (ou de nanocollecteur) de lumière. La résolution n'est alors plus fonction de la longueur d'onde d'illumination mais uniquement de la technologie de fabrication de la sonde.

Ce manque de résolution restreint l'utilisation de la microscopie en fluorescence pour l'étude des interactions protéines-protéines (voir techniques de BRET et FRET). En effet, les protéines ont une taille caractéristique de 0,1 à 1 nm). En utilisant des fluorophores pour marquer les protéines, on peut observer une éventuelle colocalisation par la superposition des deux images obtenues par excitation de chaque fluorophore qui ne permet pas de prouver une quelconque interaction : il pourrait y avoir jusqu'à 800 protéines entre les deux protéines étudiées. C'est pourquoi, pour étudier l'interaction protéine-protéine, il faut s'en remettre à d'autres techniques exploitant le phénomène de la fluorescence (FRET) ou bioluminescence (BRET).

Dans ce domaine (microscopie de fluorescence) de nombreuses techniques se sont développées.

• Le marquage simple se fait par affinité entre un fluorochrome et la molécule à marquer.
• L'immunomarquage direct ou indirect fait intervenir un anticorps marqué.
• La technique du FISH sert à marquer des séquences nucléotidiques.
• L'utilisation de protéines de fusion (typiquement, la GFP) consiste à introduire dans la cellule à observer un gène de protéine recombinante fluorescente (par transfection ou infection), la protéine synthétisée est alors fluorescente.
• Le FLIP et le FRAP consistent à irradier une zone dont la fluorescence va disparaître. Ces techniques permettent d'étudier la diffusion des molécules marquées, en effet si des molécules se déplacent la fluorescence se répartira.
• Le FRET utilise deux fluorochromes, un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Elle permet d'étudier des interactions entre deux molécules.
• le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), comme le FRET sinon que le donneur est bioluminescent (luciférase).
• la TIRFM Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy ou microscopy de fluorescence par réflexion totale interne
• la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), sert à étudier la diffusion de molécules.

La microscopie de fluorescence a de nombreux domaines d'application.